A Trastámara-ház szülöttje, II. János és Portugáliai Izabella lánya Madrigal de Las Altas Torres-ben született. Hároméves volt, amikor féltestvére, IV. Henrik került a trónra. Izabella 13 éves korában került az udvarhoz, öccsével, Alfonzzal együtt. 1469-ben házasodott össze Aragóniai Ferdinánddal, királyi hozzájárulás nélkül. Emiatt létrejött egy Aragónia-ellenes párt, akik Henrik lányát, a vitatott származású Johannát akarták trónörökösnek. Henrik is felmondta az 1468. évi megállapodást, s bár később megbékültek, a király 1474. évi halálakor örökösödési háború tört ki. Izabella, bár ellenfeleit a portugál király is támogatta, 1479-ben győzött, s II. Aragóniai János halála után ebben az évben a két királyság perszonálunióban egyesült. A tartományok önállósága sok téren megmaradt, az egységes Spanyolország csak unokájuk, V. Károly császár alatt jött létre. A Katolikus Királyok (e címet VI. Sándor pápától kapták) fő célja a reconquista befejezése, az utolsó mór terület, a granadai emírség visszafoglalása volt. E hadjárat 1482-ben kezdődött, s hosszú, költséges folyamat volt, amely kiürítette a kincstárat. Ferdinánd vezette a hadakat, Izabella a toborzást és utánpótlást intézte, s még katonai kórházat is alapított. 1491-ben Santa Fénél főhadiszállást hoztak létre, s itt maradtak Granada elestéig, 1492. január 2-ig. Itt kereste meg a királyokat Kolumbusz, aki az Indiába vezető utat nyugat felé akarta megtalálni. Az ő támogatásuk vezetett Amerika felfedezéséhez. Izabella inkább elismerte az újonnan felfedezett földrész lakóinak, az indiánoknak a jogait, mint Kolumbusz, aki a területek kormányzója lett. Aragónia még a korábbi századokban megszerezte a Baleárokat, Szicíliát, Szardíniát, a 15. század közepén Nápolyt, s akkor kezdett kibontakozni a spanyol nagyhatalom.
Ibériában régi hagyománya volt a nem keresztények és a gyanús megtértek üldözésének. E folyamat betetőzése volt az Izabella által 1480-ban létrehozott inkvizíció, amelynek vezetője Torquemada lett. 1492-ben elérte a zsidók, majd 1499-ben a mórok kiűzését, e veszteség igen kedvezőtlenül hatott a gazdasági életre. Sokat foglalkozott a művelődés kérdéseivel is, már fiatalon elolvasta Dantét, és spanyolul az Aeneist. 30 éves korában tanult meg latinul, hogy a követeket fogadni tudja. Támogatta az oktatást, a tudományt, az irodalmat, a képzőművészetet. Öt gyermeke közül három lánya élte túl, amikor 1504-ben meghalt, örököse Johanna volt, aki I. Habsburg (Szép) Fülöphöz ment feleségül. Rajta már 1501-ben kiütköztek az elmebaj jelei, az utókor Őrült Johannaként ismeri - az ő fiuk volt I. Károly spanyol király, V. Károly császár.
Izabella uralkodásának utolsó évtizedében a királyoknak sikerült hatalmuk alá vonni a lovagrendek, az alcantárai, a Calatrava- és a Santiago-rend szervezetét, amelyek a reconquista befejeződésével betöltötték szerepüket. Mindháromban Ferdinánd lett a nagymester, s erőforrásaikat beolvasztották a korona birtokai közé. Izabella nem írt emlékiratokat, végrendeletéből ismerjük leginkább politikai világlátását. Ebben józan megfontolással és uralkodói bölcsességgel fejti ki törekvéseit: az Ibériai-félsziget államainak egyesítését, a Gibraltári-szoros feletti ellenőrzés fenntartását, a muzulmán észak-afrikai területek meghódítását, az Újvilág indiánjai feletti igazságos uralkodás elveit, a hazai egyházi reform végigvitelét. A spanyolok joggal tartják Izabellát legkiválóbb uralkodójuknak. Utóda a kasztíliai trónon Szép Fülöp volt, majd - az ő 1506-os halála után - Ferdinánd uralkodott Johanna helyett. Ferdinánd 1516- ban halt meg, unokájuk, Károly követte az immár egységes spanyol trónon. A királynő életét Illés Endre dolgozta fel Spanyol Izabella című drámájában.