Eredetileg a római egyetem filozófiai szakát végezte el, és 1943-ban doktori címet is szerzett. Játszani még az egyetemi színpadon kezdett. Első filmszerepét 1946-ban alakította Roberto Rosselini híres alkotásában a Paisa-ban. Játszott a Fellini forgatókönyvírói, társrendezői közreműködésével készült filmekben, s első önálló rendezésében, a Fehér sejkben is. A világ az 1954-ben bemutatott Országúton szánnivalóan esendő, mégis költőien tiszta Gelsominájaként figyelt fel rá. A filmet Oscar-díjjal tüntették ki. Későbbi emlékezetes alakításai is elsősorban Fellini filmjeihez fűződtek (Cabiria éjszakái, Júlia és a szellemek, s végül a Ginger és Fred). 1957-ben a cannes-i filmfesztiválon a Cabiria éjszakáiban nyújtott alakításáért elnyerte a legjobb színésznői alakításáért járó díjat. 1943-ban feleségül ment Federico Fellini rendezőhöz, akivel öt évtizeden át élt együtt. Fellini 1993 novemberében meghalt, s Masina alig néhány hónappal élte túl (1994. március 23.).